- 作者: Kilby-Biot
- 來源:
- 日期 : 2025-04-13
一、實(shí)驗(yàn)背景與目的
腦類器官作為模擬人腦結(jié)構(gòu)和功能的體外三維模型，在神經(jīng)發(fā)育、疾病機(jī)制和藥物篩選研究中具有重要價(jià)值。然而，傳統(tǒng)靜態(tài)培養(yǎng)系統(tǒng)存在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)梯度不均、氧合受限等問題，影響類器官的成熟度和功能性。北京基爾比生物科技公司開發(fā)的《微重力三維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)》 通過模擬微重力環(huán)境，可顯著改善細(xì)胞外基質(zhì)分布、促進(jìn)細(xì)胞間相互作用，并減少剪切力損傷，為腦類器官的高效培養(yǎng)提供了創(chuàng)新解決方案。
本實(shí)驗(yàn)方案旨在利用北京基爾比生物公司研制的微重力三維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng) 【Clinostat, Beijing Kilby-biotech】培養(yǎng)腦類器官，評(píng)估其在微重力環(huán)境下的生長(zhǎng)特性、細(xì)胞組成及功能表現(xiàn)，并與傳統(tǒng)靜態(tài)培養(yǎng)系統(tǒng)對(duì)比，驗(yàn)證其技術(shù)優(yōu)勢(shì)。
二、實(shí)驗(yàn)材料
1. 細(xì)胞來源：人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSCs，如IMR90-4株）。
2. 培養(yǎng)試劑：
- 神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基（含LDN-193189、SB431542、XAV939等小分子抑制劑）。
- 神經(jīng)分化培養(yǎng)基（含B27、N2、BDNF、cAMP等）。
3. 微重力三維培養(yǎng)系統(tǒng)：北京基爾比生物科技三維旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器（ Clinostat, Beijing Kilby-biotech,參數(shù)：轉(zhuǎn)速5 rpm，37℃恒溫，5% CO?）。
4. 檢測(cè)工具：
- 活細(xì)胞成像系統(tǒng)（如Nikon Eclipse Ti2）。
- qPCR儀、Western blot設(shè)備、LC-MS/MS（用于神經(jīng)遞質(zhì)分析）。
三、實(shí)驗(yàn)步驟
1. 腦類器官的制備與微重力培養(yǎng)
- 階段1：神經(jīng)誘導(dǎo)（0-10天）
- 將iPSCs以2×10? cells/well接種于U型低吸附96孔板，使用神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基靜置培養(yǎng)，每2天換液。
- 微重力組：第5天轉(zhuǎn)移至微重力生物反應(yīng)器，持續(xù)旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)（5 rpm）。
- 階段2：神經(jīng)分化（10-120天）
- 將類器官轉(zhuǎn)移至6孔板，使用神經(jīng)分化培養(yǎng)基（NDM-I），微重力組維持旋轉(zhuǎn)條件。
- 第18天后更換為含維生素A的NDM-II培養(yǎng)基，添加BDNF和cAMP，每4天換液。
2. 微塑料（MP）暴露實(shí)驗(yàn)
- 參考Park et al. (2025)方法，將50 nm和100 nm熒光標(biāo)記MP（10 mg/mL）加入培養(yǎng)基，處理21天，評(píng)估MP滲透深度及毒性。
3. 檢測(cè)與分析
3.1 形態(tài)學(xué)評(píng)估：
- 激光共聚焦顯微鏡觀察類器官結(jié)構(gòu)（如神經(jīng)元層、腦室樣區(qū)域）。
- 免疫熒光染色（標(biāo)記PAX6、SOX2、TUJ1、GFAP等）。
3.2 功能分析：
- qPCR：檢測(cè)神經(jīng)發(fā)育基因（如FOXG1、OTX2）及凋亡相關(guān)基因（BAX、BCL-2）。
- Western blot：分析凋亡標(biāo)志物（cleaved caspase-3）及突觸蛋白（Synapsin-1）。
- 神經(jīng)遞質(zhì)檢測(cè)：LC-MS/MS定量谷氨酸（Glu）、γ-氨基丁酸（GABA）等。
- 微重力效應(yīng)驗(yàn)證：
- 對(duì)比靜態(tài)培養(yǎng)組，評(píng)估類器官直徑、細(xì)胞存活率（CellTiter-Glo® 3D試劑）及氧消耗率（Seahorse分析儀）。
四、預(yù)期結(jié)果
1. 微重力組腦類器官呈現(xiàn)更均勻的細(xì)胞分布、更大的體積（>500 μm）及更成熟的神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)。
2. MP暴露實(shí)驗(yàn)中，50 nm MP在微重力條件下滲透更深（>300 μm），但凋亡率顯著低于靜態(tài)培養(yǎng)組（微重力可能緩解MP毒性）。
3. 神經(jīng)遞質(zhì)分泌譜顯示微重力組Glu/GABA比例更接近體內(nèi)水平。
五、應(yīng)用前景
北京基爾比生物科技公司研制的微重力三維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng) 【Clinostat, Beijing Kilby】可優(yōu)化腦類器官的仿生性，適用于：
- 神經(jīng)毒性研究：如環(huán)境污染物（MP、重金屬）的作用機(jī)制。
- 疾病建模：阿爾茨海默病、自閉癥類器官的長(zhǎng)期培養(yǎng)。
- 藥物篩選：高通量測(cè)試神經(jīng)保護(hù)劑的療效。
北京基爾比生物公司主營(yíng)產(chǎn)品：
Kilby 3D-clinostat 三維旋轉(zhuǎn)儀，Kilby 微/超重力三維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，3D回轉(zhuǎn)重力環(huán)境模擬系統(tǒng)，隨機(jī)定位儀，
類器官芯片搖擺灌注儀，英國(guó)Kirkstall 類器官串聯(lián)芯片灌流仿生構(gòu)建系統(tǒng)